La edición genética cura la sordera en ratones de Beethoven

El nuevo enfoque, descrito hoy en la revista «Nature Medicine» , se basa en una versión más precisa y optimizada del clásico sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 –las llamadas tijeras moleculares- que mejora la capacidad para reconocer la mutación causante de la enfermedad observada en los ratones. La nueva herramienta permitió a los investigadores de Escuela de Medicina de Harvard y del Hospital Infantil de Boston (EE.UU.) desactivar de forma selectiva la copia defectuosa de un gen implicado en la audición llamado Tmc1 , mientras se conserva la copia sana. En concreto, el sistema logró reconocer una sola letra de ADN incorrecta en la copia defectuosa entre 3 mil millones de letras en el genoma del ratón.

Aunque los propios autores reconocen que todavía queda mucho por hacer antes de que una terapia de edición de genes altamente precisa como ésta pueda usarse en humanos , afirman que su trabajo representa un hito porque mejora en gran medida la eficacia y seguridad de las técnicas estándar de edición de genes.

«Nuestros resultados demuestran que esta versión más sofisticada y mejor dirigida de CRISPR / Cas9 ahora clásica logra un nivel sin precedentes de identificación y precisión», subraya el investigador David Corey. Además, establecen el escenario para utilizar el mismo enfoque para tratar otras enfermedades genéticas hereditarias que surgen de una única copia defectuosa de un gen.

Todos los seres humanos heredamos dos copias del mismo gen, una de la madre y otra del padre. En muchos casos, un gen normal es suficiente para garantizar una función normal y evitar una enfermedad. Sin embargo, en los llamados trastornos genéticos de herencia dominante, una sola copia defectuosa puede causar enfermedades.

«Creemos que nuestro trabajo abre la puerta a una herramienta hiper-dirigida para tratar una variedad de trastornos genéticos que surgen de una copia defectuosa de un gen –señala el investigador principal del estudio, Jeffrey Holt- Esto realmente es medicina de precisión».

Los ratones que llevan el gen defectuoso Tmc1 se conocen como ratones de Beethoven porque el curso de su enfermedad imita la pérdida auditiva progresiva experimentada por el famoso compositor. En los animales, el defecto de Beethoven está marcado por una letra incorrecta en la secuencia de ADN del gen Tmc1, una A en lugar de una T, un error único que marca la diferencia entre la audición normal y la sordera.

Los investigadores pensaban que deshabilitar, o silenciar, la copia mutante del gen Tmc1 sería suficiente para preservar la audición del animal, pero ¿cómo podría hacerse sin alterar también el gen saludable?

Los sistemas clásicos de edición de genes CRISPR-Cas9 funcionan mediante el uso de una molécula guía, gARN, para identificar la secuencia de ADN mutante diana. Una vez que se identifica el ADN objetivo, la enzima de corte - Cas9 - lo corta, explican. Hasta ahora, estos editores de genes han mostrado una precisión imperfecta, debido a que el ARN guía que lleva la enzima Cas9 a su diana y la enzima Cas9 que corta el ADN diana no son del todo precisos y podrían terminar cortando el ADN incorrecto.

Para resolver este problema, los investigadores adaptaron una herramienta desarrollada originalmente por Keith Joung , del Hospital General de Massachusetts , que utiliza una enzima Cas9 modificada derivada de la bacteria Staphylococcus aureus en lugar del estándar Cas9, que se deriva de la bacteria Streptococcus pyogenes.

El nuevo sistema optimizado combina dos niveles de reconocimiento: gARN para localizar el gen objetivo y una forma modificada de Cas9 que puede identificar la mutación específica del ADN en ratones Beethoven. El uso de dos formas de identificación garantiza el corte preciso y selectivo de la copia aberrante (y solo la copia aberrante) de ese gen.

«Aprovechamos el hecho de que este sistema reconoce el ADN mutante pero no el ADN normal y utiliza un sistema de reconocimiento dual para mejorar la precisión», indica el primer autor del estudio, Bence Gyorgy.

En los experimentos iniciales realizados en células con y sin la mutación de Beethoven, la herramienta distinguió con precisión entre el ADN mutante y el ADN normal en las copias del gen Tmc1. Un análisis más preciso reveló que en las células de Beethoven, que contenían una copia defectuosa y una copia normal del gen, al menos el 99 por ciento de los ‘cortes’ moleculares se produjeron exclusivamente en la copia defectuosa del gen.

El siguiente paso fue inyectar el tratamiento de edición de genes en los oídos internos de los ratones con y sin la mutación de Beethoven. El análisis de ADN mostró que las tijeras moleculares solo actuaron en las células del oído interno de ratones con el defecto de Beethoven y que no hubo alteraciones de edición en las células del oído interno de los ratones tratados que no tenían la mutación, un hallazgo que confirmó la precisión de la herramienta.

A continuación, y con el fin de probar si la terapia había interferido con la función normal de los genes, los científicos estimularon las células auditivas, llamadas células ciliadas, de los oídos internos de los ratones tratados que no tenían el defecto de Beethoven. Las células mostraron respuestas de audición normales sin cambios, confirmando que el sistema no había tenido ningún efecto sobre la función génica normal.

Y, por último, para medir si la terapia funcionó en los ani males y no solo en células, los investigadores midieron las respuestas auditivas del tronco encefálico de los ratones, que capturan la cantidad de sonido que las células ciliadas detectan en el oído interno y se transmiten al cerebro.

Sin tratamiento, los ratones Beethoven son completamente sordos a los 6 meses de edad. En comparación, los ratones sin el defecto genético conservan la audición normal durante toda la vida y pueden detectar sonidos en alrededor de 30 decibelios.

Dos meses después de recibir la terapia de edición de genes, los ratones Beethoven exhibieron una audición notablemente mejor que la de los no tratados que portaban la mutación genética. Los animales tratados fueron capaces de detectar sonidos a aproximadamente 45 decibelios, el nivel de una conversación normal, o aproximadamente 16 veces más silenciosos que los ratones no tratados. El ratón de Beethoven con la mejor conservación de la audición fue capaz de escuchar sonidos de 25 a 30 decibelios, prácticamente indistinguibles de sus compañeros sanos.

Los hallazgos demuestran que la nueva terapia génica silenció de forma eficaz la copia defectuosa del gen y evitó la pérdida de audición de los animales típica de esta enfermedad.

Además, debido a que la patología se define por una pérdida auditiva progresiva, los investigadores evaluaron el efecto de la terapia durante varios meses. Los investigadores administraron el tratamiento poco después del nacimiento y evaluaron los niveles de audición en ratones tratados y no tratados con y sin la mutación cada cuatro semanas hasta por seis meses. En el primer mes, los ratones Beethoven no tratados podían escuchar sonidos de baja frecuencia, pero tenían una pérdida de audición notable a altas frecuencias. Para el mes seis después del nacimiento, los ratones Beethoven no tratados habían perdido toda su audición. En contraste, los ratones tratados con Beethoven retuvieron una audición casi normal en bajas frecuencias, y algunos mostraron una audición casi normal incluso en altas frecuencias.

En particular, los animales tratados que no tenían el defecto genético no experimentaron pérdida de audición como resultado de la terapia génica, un hallazgo que demostró la seguridad del procedimiento y su capacidad para atacar selectivamente la copia aberrante del gen. Aún más alentador, un pequeño subconjunto de ratones Beethoven tratados que fueron seguidos durante casi un año mantuvo una audición estable y casi normal.

En un experimento final, los científicos probaron el efecto del tratamiento en una línea de células humanas que llevan la mutación de Beethoven. El análisis de ADN reveló que el tratamiento causó la edición exclusivamente en la copia mutante del gen Tmc1 y evitó la normal.

Debido a su capacidad para atacar mutaciones genéticas de un solo punto, el enfoque es prometedor para otras 15 formas de sordera hereditaria también causadas por una mutación de una sola letra en la secuencia de ADN de otros genes auditivos.

Además, la técnica podría adaptarse para su uso en otras enfermedades genéticas de herencia dominante causadas por mutaciones de un solo punto. Para determinar su utilidad hipotética, los científicos escanearon la base de datos federal ClinVar, un depósito nacional de todas las mutaciones genéticas conocidas relacionadas con enfermedades humanas. El análisis mostró que, según la especificidad de la herramienta, podía identificar correctamente 3.759 variantes genéticas defectuosas responsables colectivamente de una quinta parte de las mutaciones genéticas humanas dominantes.

«Estamos en los inicios de un largo viaje -indica Holt-. Pero lo que tenemos aquí es una prueba de concepto que demuestra que este tratamiento podría desarrollarse para silenciar selectivamente los genes que portan mutaciones puntuales y tratar, potencialmente, muchas otras enfermedades humanas».